讲座|基础科研：细胞实验相关基础知识

关于原代细胞、细胞系:

1、初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物;

2、细胞系是指来自原始组织，经过初次培养后持续传代（通常可无限传代）的细胞。常见的有HeLa（宫颈癌）、HEK293（人胚肾）、HCT116（结肠癌）、MCF-7（乳腺癌）等。

先用细胞系做高通量筛选或机制研究，找出一个有意思的靶点（比如敲除某个基因抑制了增殖）。

再用原代细胞（如从病人或者小鼠身上取的器官或原代细胞）进行验证。如果原代细胞中也观察到了同样的现象，说明这个靶点不是只在癌细胞系里才有的人工产物

一个标准细胞实验流程的思考步骤

目的： 我要研究什么？（如：药物A是否抑制肺癌细胞生长？）

选材： 用什么细胞系？（如：A549，H1299）是否需要对照细胞（如正常肺上皮细胞）？

处理： 给多长时间的药物？什么浓度？（需预实验确定IC50）

检测： 用什么实验证明？（CCK-8看活力，流式看凋亡，Western看相关蛋白变化）

对照：

空白对照： 不加药，不加转染试剂的正常细胞。

阴性对照： 如转染非特异性序列的siRNA（si-NC）。

阳性对照： 已知有效的药物或已知高表达的细胞系

细胞培养

常用细胞功能实验

1. 细胞增殖/毒性检测

CCK-8 / MTT： 最常用的方法。原理是活细胞线粒体中的脱氢酶能将试剂还原为有色物质，颜色深浅与活细胞数量成正比。

EdU 掺入： 直接检测处于DNA复制期（S期）的细胞，比CCK-8更能反映“正在增殖”的比例。

2.细胞死亡检测：Annexin V/PI 双染流式： 金标准。Annexin V 检测早期凋亡（膜磷脂酰丝氨酸外翻），PI 检测晚期凋亡/坏死（膜通透性增加）。

坏死 / 焦亡 / 铁死亡： 需要特定的抑制剂或标志物检测，如LDH释放（检测膜破裂）、Western Blot检测焦亡相关蛋白（Gasdermin D）等。

3. 细胞迁移与侵袭

4. 细胞周期与代谢

分子机制研究常用技术

1、蛋白水平

Western Blot： 检测特定蛋白的表达量、分子量、修饰状态（如磷酸化、泛素化）。是验证基因过表达/敲低效率、信号通路活性的必备手段。

免疫荧光 (Immunofluorescence, IF)： 用抗体标记蛋白，在荧光显微镜下观察蛋白的定位和共定位情况。

免疫共沉淀 (Co-IP)： 研究蛋白与蛋白之间是否存在直接或间接相互作用。

2. 基因水平

qRT-PCR (实时荧光定量PCR)： 检测mRNA的表达水平。

CRISPR/Cas9： 基因编辑技术，用于构建基因敲除细胞系。

RNA干扰 (siRNA/shRNA)： 用于基因敲低，研究基因功能。

质粒转染： 将外源基因导入细胞，实现过表达。