讲座|免疫组化在肺肿瘤病理诊断中的应用新进展（二）
（三）神经内分泌肿瘤（NET）
包括肺高级别小细胞肺癌（SCLC）、大细胞神经内分泌癌（LCNEC）、高分化典型类癌（TC）和非典型类癌（AC），通常要借助IHC证明神经内分泌分化才能确诊。目前的WHO分类中，LCNEC诊断不仅需要神经内分泌形态学表现，还需要至少1种神经内分泌标志物的IHC表达。
CgA、Syn和CD56 最常用的神经内分泌肿瘤标志物组合
CgA（嗜铬粒蛋白A）是一种大分泌颗粒位于基质中的蛋白，特异性最强。
CD56 （神经细胞黏附分子）主要分布于神经外胚层来源细胞。最为敏感但缺乏特异性。
Syn（突触素）存在于神经内分泌细胞中，在小细胞肺癌中表达较多，在鳞癌表达极少，因此可用于小细胞癌与肺鳞癌的鉴别诊断。
Ki-67（增殖指数）
1. Ki-67有助于鉴别不同类型的神经内分泌肿瘤。
典型类癌的Ki-67增殖指数≤5%（低级别），非典型类癌为5%~20%（中级别），大细胞肺癌≥60%（高级别），小细胞肺癌为50%～100%（高级别）；
2. Ki-67阳性率越高，肿瘤生长越快，组织分化越差 ，对化疗也越敏感。
小细胞肺癌
1. CgA Syn CD56 是最常用的神经内分泌肿瘤标志物组合。
2. Ki-67是鉴别小细胞肺癌和低中级别神经内分泌肿瘤的重要指标，Ki-67在小细胞肺癌中一般较高，为50%～100%。
3. 2023版CSCO指南里新增了INSM1（胰岛素瘤相关蛋白1）作为小细胞肺癌的免疫组化标志物，多项研究证明了INSM1在肺神经内分泌肿瘤具有优秀的敏感性和特异性。
而且INSM1是细胞核染色，上述3个经典的标志物是细胞质或细胞膜染色，对组织损伤较重的标本，INSM1核染色更明显，采用INSM1更有优势。
肺部TC、AC、LCNEC和SCLC标志物
备注：+：>75%病例呈阳性；+/–：通常>50%病例呈阳性；–：<5%病例呈阳性；–/+：不到50%病例呈阳性。
上表归纳了用于诊断NET以及区分NET与其他NSCLC的IHC标志物，包括CgA、Syn、CD56和INSM1。
Syn是敏感的标志物，特别是对LCNEC。
CD56对SCLC有较高的敏感性，但特异性差。
CgA在类癌肿瘤中常呈强烈且弥漫的阳性染色，但在SCLC和LCNEC的某些肿瘤细胞中可能仅存在局灶阳性。
最近多项研究的可靠数据证实了INSM1是一种有诊断价值的神经内分泌标志物，因为它对整个NETs谱具有高度特异性和敏感性，不受起源器官和组织学分级影响。建议CD56与INSM1和/或Syn组合作为确认肺高级别NET的首选
A：肺小细胞癌CK(CAM5.2)阳性染色（核周点状图案）；B：Syn；C：CD56；D：CgA（弱，点状）；E：INSM1核染色；F：高Ki-67指数。
（四）其他类型肺肿瘤免疫组化
1、大细胞肺癌是一种未分化的非小细胞肺癌，其在细胞学和组织结构及免疫表型等方面缺少小细胞癌、腺癌及鳞癌的特征。由此可见，大细胞肺癌是一类排他性诊断，指的是除外小细胞癌、腺癌和鳞癌之后的排除性诊断。
大细胞癌中TTF-1或Napsin A和p40、p63或CK5/6的IHC标志物均应呈阴性。大细胞癌诊断还需观察黏蛋白染色的2个高倍视野，每个视野呈阴性或<5个阳性细胞。最重要的是，诊断前必须通过CK（Pan）或CK7证明上皮分化。如果不存在神经内分泌形态，则不推荐使用神经内分泌标志物。如果形态学上未分化的NSCLC（CK阳性、TTF-1阴性、p40阴性）神经内分泌标志物阳性，则应称其为伴有神经内分泌分化的大细胞癌。
2、肉瘤样癌（SC）是一种异质性肿瘤，包括多形性癌（PC）、癌肉瘤。多形性癌是一种低分化NSCLC，含1种或多种常规癌成分，其中至少有10%以梭形细胞或巨细胞为特征的肉瘤样成分，或由恶性梭形细胞（梭形细胞癌）或肿瘤巨细胞（巨细胞癌）组成的癌。多形性癌中的IHC染色有助于突出显示不同的成分。由于CK染色通常很弱甚至缺失，因此需要多种CK标志物标记。当肉瘤样成分占主导地位且CK表达非常微弱或缺失时，诊断就具有挑战性，必须进行IHC检测以区分肺肉瘤样癌与其他梭形细胞肿瘤，包括肉瘤样间皮瘤、原发性或转移性肉瘤、转移性肉瘤样肾细胞癌和黑色素瘤等。通过应用现有的IHC标志物，黑色素瘤（S100、SOX-10、Melan-A等）和某些梭形细胞肿瘤/肉瘤，如：孤立性纤维瘤（STAT6、CD34)，肌源性肿瘤（SMA、Desmin和其他肌源性抗体），滑膜肉瘤 (SS)（TLE1、CD99、Bcl-2、SS18-SSX）、血管瘤（CD31、ERG和FLI-1）、和周围神经鞘瘤（SOX-10、S100、H3K27me3缺失），都有可能在适当的临床背景下被诊断或排除。当IHC检查无法提供信息时，最终诊断需要将临床信息和放射学结果进行关联，有时还需要进行分子分析。肺肉瘤样癌与肉瘤样间皮瘤的区别将在间皮瘤部分讨论。
3、胸部SMARCA4表达缺失的未分化肿瘤(SMARCA4-dUT)是一种最近定义的高度侵袭性胸部肿瘤，常见的部位是纵膈中部，其次是胸膜和肺。免疫组化方面，该肿瘤具有SMARCA4缺失，以及SOX2、CD34和SALL4的强表达，这已在多项研究中证实。此外，肿瘤经常显示局灶性微弱的CK表达（CK(Pan)或EMA）但Claudin4基本呈阴性。SMARCA4-dUT保留INI-1表达。还观察到Syn阳性。极少数病例呈p63、TTF1、p40和WT1阳性。主要鉴别诊断是SMARCA4缺陷型NSCLC、NUT癌、黑色素瘤或其他低分化或未分化癌症。SMARCA4缺陷型NSCLC始终包含形态学上与SMARCA4-dUT不同的鳞状和实性成分，并且SMARCA4-dUT中SOX2、CD34和SALL4的表达，使区分这两种肿瘤成为可能。SMARCA4-dUT的SMARCA4、 Desmin、NUT和S100呈阴性，这有助于其与NUT癌、黑色素瘤或一些低分化或未分化癌的区分。
4、NUT癌 是一种低分化癌，由位于15q14上的NUT基因发生重排而定义，预后不佳。形态学特征是由单个小到中等大小的原始肿瘤细胞组成的片状、巢状细胞，偶有突然的角化病灶。仅凭形态学表现经常会导致NUT癌误诊为基底细胞样鳞状细胞癌、小细胞肺癌、淋巴瘤或某些生殖细胞肿瘤。免疫组化上，NUT癌鉴定需要NUT蛋白的核表达。独特的NUT蛋白表达模式（斑驳状阳性）仅限于NUT癌，可用于NUT癌与其他相似肿瘤的鉴别诊断。此外，大多数NUT 癌CK（Pan）阳性，并经常显示p40/p63核染色，提示鳞状分化。但有趣的是，分子研究发现，除了涉及NUT染色体易位外，NUT癌几乎没有其他遗传学改变，而肺鳞状细胞癌的特点是复杂和多种细胞遗传学改变。偶尔，NUT癌可进行Syn、CgA或罕见TTF-1的染色。需注意的是，NUT癌常呈CD34阳性，这可能会导致误诊为白血病。但NUT癌对其他骨髓细胞、淋巴瘤和生殖细胞标志物呈阴性，这有助于与白血病的区分。其他差异化考虑因素是 SMARCA4-dUT，同样，SMARCA4和NUT的IHC染色可帮助鉴别
（五）肺癌与胸膜间皮瘤的鉴别
1. 尚无100%的特异性标志物，因此应至少选择2个间皮和2个上皮标志物。
2. 根据抗体的敏感度和特异度，间皮瘤最好的标记为钙视网膜蛋白（Calretinin）、CK5或CK5/6、Wilms 肿瘤基因1（Wilms tumour gene-1，WT-1）和D2-40。
（六）肺原发性和继发性肿瘤间的鉴别
当考虑原发性未知的癌症时，包括CK7和CK20在内的一组CK标记物是合理的初始步骤，下表总结了不同器官部位癌的CK7和CK20染色谱；列出的肿瘤特异性标志物可进一步帮助诊断肺原发性腺癌或特定器官的转移性癌。TTF-1和/或NapsinA是鉴别所必须使用的标志物,因为当可排除甲状腺和肾脏原发性病变后，这两种标志物对肺原发性腺癌有高敏感性和特异性。在区分肺原发灶和转移灶时，TTF-1的克隆8G7G3/1优于SPT24，因为8G7G3/1 比SPT24 对肺腺癌更具特异性。近年来，建立了许多特异性的IHC指标。一些在肺癌中不表达或罕见表达的标志物是鉴定肺癌和转移性癌的最佳标志物。
肺腺癌与转移性癌的鉴别诊断标志物
备注：+：>75%病例呈阳性；-：<5%病例呈阳性；+/-：<50%病例呈阳性
A：转移性乳腺癌，GATA3核染色； B：转移性结肠腺癌SATB2核染色
病理医生应根据显微镜下的组织学形态，选择合适的免疫组化标记物进行诊断及鉴别诊断，尤其是在低分化癌中免疫组化显示了极其重要的作用。如果TTF-1、Napsin A、CK7阳性，则提示为腺癌；如果p40、CK5/6阳性，则提示为鳞癌；如果CGA、CD56、syn、INSM1阳性，则提示为神经内分泌癌。
对于原发性和转移性肺癌鉴别诊断，需要用到不同部位肿瘤相对性的免疫组化抗体了，如胃肠道癌转移：CDX2、CK20、SATB2；乳腺癌转移：GATA3、ER/PR；前列腺癌转移：PSA等。
三、治疗和预后的标志物
指导肺癌治疗的标志物
随着诊断技术的发展以及肺癌新药的快速上市，用来指导肺癌治疗的标志物也更新得很快。
最新发布的2023版CSCO肺癌诊疗指南，对于不可手术的III期、IV期非鳞非小细胞肺癌患者，I级推荐里除了检测EGFR、ALK、ROS1、RET、MET14跳跃突变外，新增了对BRAF V600突变、NTRK融合突变的检测。II级推荐还建议进行KRAS、HER-2突变、MET扩增等基因变异检测。
美国新发布的NCCN指南对标志物的检测也有修改，将PD-L1检测提前到第一位，排在了EGFR、ALK之前，而且此前仅建议II-IIIA期患者检测PD-L1，这次的新版本里去掉了分期限制，建议所有患者都做，足见NCCN专家组对PD-L1新辅助免疫治疗的重视。我国指南目前还是建议不可手术的III期、IV期非小细胞肺癌患者检测PD-L1，不过未来的趋势肯定是向NCCN看齐。
想要精准检测这些指导治疗的标志物，需要多种检测方法的交叉验证，除了基于蛋白质层面的免疫组化外，二代基因测序也是目前常用的方法。NGS不但能利用组织活检，还能利用外周血来检测循环游离肿瘤细胞ctDNA，这种技术对于身体状况不支持组织活检的晚期患者可能会更加友好。
1.EGFR ：可作为一种快速、经济的初筛方法。如果存在EGFR蛋白的过表达，提示对EGFR-TKI类靶向药（如吉非替尼、奥希替尼等）敏感，此时则提示需要EGFR基因突变的检测，如PCR或NGS。
2. ALK ：阳性通常提示存在ALK基因融合，对ALK-TKI类靶向药（如克唑替尼、阿来替尼等）高度敏感，通常需通过FISH或NGS确认。
3.ROS1：阳性提示存在ROS1基因融合，阳性患者可从靶向治疗中显著获益，改善预后，通常需通过FISH或NGS进一步确认。
4.PD-L1 ：这是目前最重要的免疫治疗预测指标。肿瘤细胞和免疫细胞上的PD-L1表达水平可以帮助预测患者从PD-1/PD-L1抑制剂中获益的可能性。
5.Ki-67：是一种细胞增殖相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，可用于评估化疗是否对患者有效。
化疗药物的作用机理就是破坏生长期细胞（G1、S、G2 和 M 期）的各类生物活动，对静止期细胞作用微弱。Ki-67数值高的肿瘤生长越快，组织分化越差，对化疗也越敏感，往往化疗效果会更好。所以Ki67是用于评估恶性程度及辅助判断预后的指标。至于哪个范围算高哪个范围算低，则与具体肿瘤相关，不能简单一概而论。
Ki-67对肺神经内分泌癌具有诊断和分级双重作用。如典型类癌的Ki-67增殖指数≤5%，属于低级别，非典型类癌为5%~20%，属于中级别，大细胞肺癌通常≥60%，属于高级别。
免疫组化的意义
1.明确诊断与分型：鉴别病变为腺癌、鳞癌、小细胞癌或其他类型的肿瘤；
2.指导精准治疗：判断是否存在可用的靶向药物，或是否适合免疫治疗；
3.判断肿瘤起源：区分原发性肺癌与转移性肺癌；
4.评估预后：某些免疫组化标志物的表达水平与患者预后密切相关。
四、总结
本课件简要介绍了肺肿瘤相关免疫组化的意义，随着精准医学时代的到来，免疫组化乃至分子检测等检查已经是病理诊断工作中的重要延伸和拓展。首先我们要学会妥善、合理地运用好各项检查、打好组合拳；其次更要做好精准判读和客观解释；必要时还应参考临床病史、影像学资料和常规（HE）切片，综合全面客观准确判断！
一份规范的病理报告不仅要全面客观准确反映出患者的病情，还要为临床的精准治疗提供关键的可靠的诊断依据，同时对患者的预后起到一定的预估作用。
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